一、TUNEL检测：

TUNEL染色是检测细胞凋亡染色的常见方法，其原理是细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素、生物素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或化学显色方法检测细胞凋亡的情况。

二、样本准备

根据样本选择相应样本处理，动物组织需包埋选择1，动物组织需冰冻选择2，细胞爬片样本选择3，细胞涂片样本选择4。

1、 石蜡包埋组织切片

① 将组织切片放入二甲苯中浸泡5min，重复1次，以彻底脱掉石蜡。

②  100%乙醇浸泡5min，重复1次。

③ 梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

④ PBS轻轻润洗，滤纸小心吸干多余液体。用石蜡笔或疏水笔在周围描绘样品分布轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。

⑤ 配制Proteinase K工作液：PBS稀释2mg/mL的Proteinase K溶液（1:100），终浓度为20μg/mL。

⑥ 滴100μL上述Proteinase K工作液，使其全部覆盖，孵育20min。

⑦ PBS润洗样本，并用滤纸小心吸样本周围液体。处理后放于湿盒保存。

2、组织冰冻切片

① 玻片浸没于4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，孵育15min。

② 用滤纸小心吸干周围多余液体。

③ 将玻片浸没于PBS溶液，孵育15min。

④ 用滤纸小心吸干周围多余液体。用石蜡笔或疏水笔在周围描绘样品分布轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。

⑤ 配制Proteinase K工作液：PBS稀释2mg/mL的Proteinase K溶液（1:100），终浓度为20μg/mL。

⑥ 滴加100μL上述Proteinase K工作液，使其被全部覆盖，室温孵育10min。

⑦ 用PBS溶液润洗样本3次。

⑧ PBS润洗样本，并用滤纸小心吸样本周围液体。处理后放于湿盒保存。

3、细胞爬片的准备

在Lab-Tek载玻片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

4、 细胞涂片的制备

① 准备多聚赖氨酸包被的载玻片：100 μL 0.01% (w/v)多聚赖氨酸水溶液滴至载玻片表面，涂散为一薄层，晾干。去离子水漂洗，晾干30-60 min。

② 以约2×10⁷个细胞/mL的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取100μL细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用一片干净载玻片轻柔涂开细胞悬液。

③ 固定细胞，将载玻片浸入含4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛染色缸中，4℃放置25min。

④ 洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。重复用PBS洗1次。

⑤ 用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。

⑥ 配制Proteinase K工作液：PBS稀释2mg/mLProteinase K溶液（1:100），终浓度为20μg/mL。

⑦ 滴加100μL上述Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育5min（或浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液，孵育5min进行通透处理）。

⑧ 在盛有PBS溶液敞口烧杯中浸没清洗样本2次。

⑨ 用滤纸小心吸样本周围液体。处理后放于湿盒保存。

三、实验流程

① 按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。

② 样本滴加100μL 1×Equilibration Buffer，使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30min。或将载玻片放入1个含1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。平衡细胞的同时在冰上解冻FITC-12-dUTP Labling Mix，并依下表，准备足够量的用于所有实验和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。

表 准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

阴性对照体系：准备1份不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH₂O替代TdT酶。

③ 平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，在5cm²面积细胞上加入50μLTdT孵育缓冲液。之后操作用铝箔纸包裹避光处理。

④ 塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布。湿盒底部放上用水浸湿的纸巾，将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60min。

⑤ 移除塑料盖玻片，将切片置于PBS溶液孵育5min。

⑥ 轻轻去掉多余液体，换用新鲜PBS溶液孵育5 min，重复1次。

⑦ 用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

⑧ 样本在染色缸染色，在黑暗中将载玻片浸入装有PI溶液（1μg/mL，用PBS新鲜配制并稀释）的染色缸，放置5min。

⑨ 洗涤样本，将载玻片浸入去离子水，放置5min，重复2次，总共洗3次。

⑩ 叩干载玻片上多余水且用吸水纸擦拭细胞周边区域。

⑪ 立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光；在＞620nm下观察PI的红色荧光，或在460nm观察蓝色的DAPI。如有必要，载玻片能在4℃黑暗条件下存放过夜。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。

四、样本要求及运输条件：

1、提供固定完全的组织样本。组织离体后，选择合适的固定液和容器立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，固定时间建议24-48h，大标本固定12h，再切开固定。固定完全后尽快送检。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。

2、提供编号清晰的蜡块或蜡头。

3、石蜡切片常温运输，冰冻切片-80℃保存干冰运输。

4、爬片必须充分固定，常温运输。

五、注意事项：

1、任何实验方法都存在局限性，根据TUNEL实验的本质问题，公司不能保证结果中凋亡细胞的多少（即假阳性、或偏阴性结果）。

2、TUNEL染色建议先做预实验（预实验由客户提供预期高表达的样本，蜡块或切片皆可），确认效果后，再做正式实验。预实验结果优先由客户自行确认，预实验和正式实验间隔周期不要太久，建议连续三周内完成。

3、正式实验的趋势我司不做保证。

六、实验图：