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题目：甘草的抗结直肠癌作用及其通过HPLC整合和网络药理学方法的潜在机制
英文名：Anti-colorectal cancer actions of Glycyrrhiza uralensis Fisch. and its underlying mechanism via HPLC integration and network pharmacological approaches
杂志：Phytomedicine
影响因子：6.7
发表时间：2025年1月6日
研究背景：结直肠癌（CRC）发病率和死亡率高，现有治疗手段副作用显著。甘草在抗癌中具潜力，但其抗CRC的关键活性成分及机制尚不明确，亟需系统研究。
研究思路：本研究先通过HPLC鉴定甘草中的活性成分，再利用网络药理学筛选潜在靶点并构建“成分-靶点-通路”网络，结合分子对接和分子动力学模拟验证成分与靶点的结合能力，最后通过SW480细胞实验（增殖、迁移、侵袭等）和裸鼠异种移植模型实验，验证主要成分甘草苷（甘草苷）的抗CRC作用及机制。
研究结果：
1、甘草提取物中活性成分分析
基于前期实验和文献，对相关标准品和制备的甘草提取物进行HPLC分析。HPLC结果如图1A和B所示。通过样品与标准品的保留时间比较，检测到7种化合物：芦丁（图1C）、甘草查尔酮A（图1D）、甘草酸（图1E）、异甘草苷（图1F）、甘草素（图1G）、异甘草苷芹糖基（图1H）和甘草苷（图1I）。
图1
2、甘草主要活性成分治疗CRC的网络药理学分析
从GeneCards数据库收集CRC（疾病）相关靶点，鉴定出322个与药物靶点相交的靶点（图2A）。如图2B所示，较大和较暗的节点表示可能与CRC关联更密切的靶点，鉴定出的靶点包括TP53、SRC、STAT3和PIK-3CA，成为前四个核心靶点，这些节点代表了甘草活性成分抗CRC的关键靶点，在其治疗效果中起核心作用。对七种活性成分治疗CRC的基因本体（GO）功能富集分析产生了1,285个GO术语（P<0.05），包括860个生物过程（BP）术语，涉及信号转导、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶II启动子转录正调控、细胞凋亡负调控和细胞增殖正调控、炎症反应和蛋白质自磷酸化等（图2C）。在DAVID数据库中对七种活性成分与CRC的322个相交靶点进行分析，鉴定出177条KEGG通路，这些通路在CRC治疗的关键靶点中富集（图2D）。KEGG通路分析后，将通路中鉴定的靶点映射到其相应的化合物，并使用Cytoscape（3.7.2）构建“活性成分-靶点-通路”网络，结果显示该网络由279个节点和1,238条边组成，包括7个活性成分、252个靶点和20条信号通路（图2E）。这表明甘草的活性成分可以通过多种化合物和靶点作用于多个通路，共同促成治疗CRC的效果。
图2
3、分子对接和分子动力学模拟分析
对接能值<-4.25kcal/mol（1cal≈4.186J）通常是可接受的，表明分子之间有结合活性，而<-5.0kcal/mol和<-7.0kcal/mol分别表示良好和强结合活性。核心靶点基因与核心成分之间的结合能如图3B所示。在这些成分中，甘草酸表现出最强的结合能力，甘草苷排名第二。这两种活性成分与TP53、SRC、STAT3和PIK3CA蛋白的分子对接结果如图3A所示。如图3C所示，甘草苷-TP53复合体系在40ns后达到平衡，RMSD波动稳定在约2.2Å左右，表明配体与靶蛋白的结合稳定性高。进一步分析显示，模拟过程中回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）的波动较小（图3D和E），表明配体结合后蛋白质的构象发生了变化。氢键在配体-蛋白质相互作用中起关键作用。如图3F所示，配体与蛋白质之间的氢键数量在0到4之间，平均约3个键，表明存在强氢键相互作用。均方根波动（RMSF）用于评估蛋白质中氨基酸残基的灵活性。如图3G所示，RMSF值相对较低（大多低于3Å），表明灵活性降低，稳定性增加。总之，甘草苷-TP53复合体系表现出高结合稳定性和强氢键相互作用，表明甘草苷与TP53的有效结合。
图3
4、体外实验
HPLC、网络药理学和分子对接数据结果表明，甘草中的甘草苷和甘草酸均对CRC表现出较强的抑制作用。因此，进行细胞实验以比较它们对CRC的抑制能力。如图4A和B所示，将不同浓度（μM）的甘草苷（25、50、100、200和400）应用于SW480细胞24和48小时，导致不同程度的细胞活力抑制，结果显示，甘草苷以剂量依赖性方式抑制SW480细胞的增殖，而甘草次酸则不然。因此，在后续实验中，选择50、100和200μM的甘草苷浓度进行48小时处理。集落形成实验的结果如图4C和D所示，与对照组相比，甘草苷组形成的细胞集落数量显著减少。同样，奥沙利铂组的细胞集落数量也减少，差异具有统计学意义（P<0.01）。用甘草苷（50、100、200μMol/L）处理SW480细胞48小时后，结果显示，与对照组相比，甘草苷以剂量依赖性方式促进SW480细胞凋亡，如图4E所示。
图4
5、甘草苷抑制SW480划痕、迁移和入侵实验
与对照组相比，阳性药物组的细胞迁移率和迁移细胞数量减少，如图5a和B所示，划痕区域愈合明显受到抑制，细胞迁移减慢。在药物处理组（48小时），50-200μM浓度显著抑制SW480细胞的迁移，表明甘草苷有效降低细胞的迁移能力，效果具有统计学意义（P<0.01）且呈浓度依赖性。使用Transwell方法评估甘草苷对SW480细胞迁移和侵袭能力的影响，如图5C-F所示，结果显示，处理48小时后，与对照组相比，阳性对照组的迁移细胞数量显著减少，差异具有统计学意义（P<0.01）。在200μM浓度的甘草苷组中，与对照组相比，细胞迁移和侵袭均减少，变化具有统计学意义（P<0.05），表明甘草苷有效减弱SW480细胞的迁移和侵袭能力。使用westernblot分析SW480细胞中侵袭蛋白的表达，结果显示，随着甘草苷浓度的增加，蛋白质水平显著下降。在200μM以及阳性对照组中，MMP蛋白（-1、-3和-9）的表达被显著抑制，此外，在100μM时，MMP-1的表达也显著降低（图5G-J），差异具有统计学意义（P<0.01）。研究结果表明，甘草苷可有效阻碍侵袭相关蛋白的表达，从而降低SW480细胞的侵袭潜力。
图5
6、甘草苷对裸鼠SW480异种移植模型状态和肿瘤大小的影响
在BALB/c裸鼠接种SW480细胞后的第3至4天，在右腋窝检测到可触及的实体瘤，然后在肿瘤植入后的第7天开始腹腔注射甘草苷，并持续12天。在实验过程中，模型组和治疗组的裸鼠均未死亡。肿瘤建模成功后，两组均表现出正常的饮食和活动，体重无明显变化。在治疗期间，甘草苷治疗组的整体状况优于模型组，各组之间体重无显著差异，且这些差异无统计学意义（图6A和B），表明甘草苷在体内给药是安全的。处死小鼠后，切除肿瘤并称重。如图6C和D所示，与模型组相比，甘草苷治疗组的肿瘤重量显著降低（P<0.05），且这种降低呈剂量依赖性，从而表明甘草苷对裸鼠SW480异种移植物的生长具有抑制作用。
图6
7、甘草苷对裸鼠SW480异种移植肿瘤组织中p53/p38MAPK通路表达水平的影响
基于PPI网络、分子对接和KEGG通路分析，推测甘草苷可能通过靶向p53来调节MAPK信号传导，western blot结果显示，100和200μM甘草苷治疗组的p-p53/p53水平显著高于模型组（P<0.01），而任何浓度的p-p38MAPK/p38MAPK均显著降低（P<0.01）（如图7A和C所示）。HE染色结果证实，模型组的肿瘤组织表现出细胞弥漫性生长，细胞排列紧密，形态基本完整（如图7D所示）。这些发现表明，甘草苷导致裸鼠SW480异种移植组织发生显著的结构变化。因此，研究结果证实，甘草苷可能通过p53/p38MAPK信号轴抑制裸鼠SW480异种移植物的生长。
图7
总结：研究证实甘草中的甘草苷通过靶向p53并抑制p38MAPK通路，显著抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠肿瘤生长，为甘草治疗CRC提供了药理基础和潜在靶点。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
