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题目：三阴性乳腺癌异质性免疫微环境的多组学分析表明UQCRFS1增强肿瘤进展

英文名：Multi-omics analyses of the heterogenous immune microenvironment in triple-negative breast cancer implicate UQCRFS1 potentiates tumor progression

杂志：Exp Hematol Oncol

影响因子：13.5

发表时间：2025年6月16日

研究背景：三阴性乳腺癌（TNBC）通常以高级别和侵袭性特征为特征，导致患者远处转移的可能性增加，预后较差。肿瘤免疫微环境（TME）最近被认为与肿瘤进展和免疫治疗反应密切相关。然而，TNBC中实际的异质性TME仍有待探索。

研究思路：在自我测试的单细胞RNA测序数据集上对TME内的不同细胞类型进行全面分析，该数据集包含9例TNBC初治患者，包括亚簇分类、CellChat算法、转录因子（TFs）表达、伪时间分析和功能富集测定。通过拷贝数变异分析证实恶性上皮簇，随后进行LASSO-Cox回归，以5个关键基因为基础建立恶性细胞指数（MCI）模型，该模型通过Kaplan-Meier生存和免疫治疗反应分析在多个TNBC队列中得到验证。利用空间转录组、蛋白质组数据和qRT-PCR、western blotting实验来证实RNA和蛋白质水平的UQCRFS1表达。此外，还实施了功能实验以揭示UQCRFS1对TNBC细胞的影响。

研究结果：

1、单细胞图谱涵盖TNBC患者的细胞组成

为解析未治疗三阴性乳腺癌的异质免疫微环境，收集9例患者的活检肿瘤组织进行单细胞RNA测序（图1A、B）。剔除低质量细胞后，最终获得92,304个细胞，将其分为8种主要细胞类型，即B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、壁细胞、髓系细胞、浆细胞和T细胞。基于患者标签或主要细胞类型的UMAP可视化如图2A、B所示，图2C显示了9例患者中8种主要细胞类型的比例。此外，这些主要细胞类型通过经典谱系标志物定义（图2D-F）。CellChat分析发现，成纤维细胞和髓系细胞在数量和强度上的相互作用最显著（图2G）。值得注意的是，成纤维细胞的输出信号频率highest，而髓系细胞的输入信号频率highest，表明它们在TNBC微环境中起重要作用（图2H）。总之，TNBC的异质TME基于多种细胞类型及其强烈的相互作用。

图1

图2

2、三阴性乳腺癌中髓系细胞的特征

基于tSNE算法，髓系细胞被重新聚类为6个亚群，即巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、耐受性树突状细胞（tDCs）、浆细胞样DCs（pDCs）和常规DCs（cDCs）（图3A），亚群标志物如图3B、C所示。重点研究巨噬细胞，确认了4个亚群，包括S100A8+巨噬细胞、IL1B+巨噬细胞、FOLR2+巨噬细胞和MKI67+巨噬细胞（图3D）。小提琴图显示各亚群标志物的表达水平，证实聚类准确性（图3E）。此外，CellChat分析发现巨噬细胞各亚群间存在广泛通讯（图3F）。功能富集分析显示各亚群富集不同通路（图3G）。代谢分析表明FOLR2+和MKI67+巨噬细胞代谢活性较高（图3H）。转录因子分析发现各亚群转录因子表达不同，且与不良预后相关（图3I、J）。总之，髓系细胞尤其是巨噬细胞的异质性与TNBC不良预后相关。

图3

3、三阴性乳腺癌中成纤维细胞和B/浆细胞的多样性

越来越多的证据表明，原发或转移性肿瘤的成纤维细胞具有显著的适应性、可塑性和韧性，通过与TME中的各种细胞群相互作用促进肿瘤进展[44]。对成纤维细胞进行重新聚类，基于tSNE算法明确了4个集群（Fib_C0-C3）（图4A）。热图显示这些集群间的差异表达基因（图4B）。CellChat分析表明Fib_C0和Fib_C1集群的通讯比Fib_C2和Fib_C3更频繁（图4C）。拟时序分析显示从Fib_C2到其他集群的分化轨迹（图4D、E）。KEGG富集分析发现Fib_C0和Fib_C1富集多种通路（图4F）。表面蛋白基因表达比较显示Fib_C0和Fib_C1与多种extracellular基质等相关基因相关（图4G）。随后，确认了2个B细胞亚群（naive和记忆B细胞）和2个浆细胞亚群（JCHAIN+和IGG+浆细胞）（图4H），各亚群标志物如图4I、J所示。Monocle分析阐明了从B细胞到浆细胞的分化过程（图4K）。通路富集分析显示naive和记忆B细胞免疫调节通路活跃，而浆细胞亚群泛素介导的蛋白水解等通路活跃（图4L）。转录因子分析显示浆细胞亚群XBP1表达升高，B细胞亚群STAT1表达升高（图4M、N）。总之，成纤维细胞和B细胞的多样性在分化轨迹等方面得到阐明。

图4

4、三阴性乳腺癌中T/NK细胞的区分

T细胞和NK细胞也是TME的重要组成部分。筛选出T/NK细胞并重新命名，鉴定出CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞（Tregs）、MKI67+T细胞、NK细胞和NKT细胞（图5a），各细胞类型标志物如图5B所示。CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tregs的亚群如图5C、D所示。CellChat分析发现各亚型与上皮细胞的通讯存在差异（图5E）。免疫相关基因表达和功能评分显示各亚型存在显著差异，IL32high Treg在免疫逃逸中起重要作用（图5F、G）。通路富集分析显示IL32high Treg富集更多免疫失调相关通路（图5H）。生存分析表明IL32high Treg浸润多的患者预后差（图5I）。总之，TNBC免疫细胞异质性显著，IL32high Treg可能促进免疫逃逸。

图5

5、三阴性乳腺癌上皮细胞集群亚群的区分

为确定TNBC上皮细胞的异质性，通过“inferCNV”算法识别正常和恶性上皮细胞，并对恶性细胞进行重新聚类，确定8个亚群（Malignant_C0–C7）（图6A、B）。各集群标志物如图6C所示。CNV评分比较显示Malignant_C3的CNV评分显著高于其他集群（图6D）。CellChat分析显示Malignant_C5的互作数量最多（图6E）。功能富集分析显示各亚群参与不同功能通路（图6F、G）。转录因子和免疫相关基因表达分析显示各亚群存在差异（图6H、I）。总之，TNBC恶性细胞亚群的独特特征可能通过多种功能通路对TME发展起重要作用。

图6

6、基于三阴性乳腺癌恶性上皮标志物的MCI构建和验证

为挖掘恶性上皮细胞中差异表达标志物的临床价值，利用单变量Cox回归和LASSO算法在TNBC患者的bulk转录组数据中筛选出具有预后意义的恶性基因。训练集包括GSE58812和TCGA-TNBC数据集，验证集包括METABRIC和GSE21653数据集。通过单变量Cox回归和重叠分析，在训练集中筛选出28个共同基因（图7A、B），最终通过LASSO算法选择5个基因构建恶性细胞指数（MCI）（图7C）。PCA分析显示在训练和验证队列中基于MCI的区分效果良好（图7D）。MCI值调整后显示MCIhigh组死亡患者比例可能更高（图7E）。热图显示5个关键基因在MCIhigh患者中均上调（图7F）。Kaplan-Meier生存分析显示MCIhigh患者生存率显著降低（图7G）。总之，内部训练和外部验证表明MCI在监测TNBC患者生存结局方面具有潜力。

图7

7、MCI能够预测三阴性乳腺癌患者的免疫治疗反应

森林图显示在GSE58812队列中，MCI是独立预后指标（图8A、B）。通过多变量Cox和逐步回归分析构建列线图模型，可估计2、3和5年OS概率（图8C）。校准曲线显示预测与观察的生存率一致性良好（图8D）。决策曲线分析显示列线图性能优于其他预测因子（图8E）。列线图评分分析显示低评分患者预后更好（图8F）。为探索MCI是否与免疫治疗反应预测相关，收集接受ICB（度伐利尤单抗联合奥拉帕利）和紫杉醇治疗的TNBC患者的转录组数据。计算每位患者的MCI，结果显示对ICB无病理完全缓解（nCR）的TNBC患者MCI值高于有病理完全缓解（pCR）的患者（图8G）。基于MCI中位数分组，MCIhigh亚组nCR患者比例显著更高（图8H）。ROC分析显示AUC值为0.733（图8I）。此外，在7例接受新辅助ICB治疗的患者中验证，nCR组累积MCI更高（图8J-M）。各主要细胞类型中，除正常上皮细胞外，nCR组MCI值显著升高（图8N）。总之，这些发现表明MCI可预测TNBC患者的免疫治疗不良反应。

图8

8、UQCRFS1是潜在生物标志物，促进TNBC细胞的增殖和迁移

为探索UQCRFS1在TNBC中的表达和临床意义，在GSE76250数据集中比较配对的非肿瘤和TNBC样本中UQCRFS1的表达，显示TNBC组织中UQCRFS1明显升高（图9A）。qRT-PCR发现TNBC细胞系中表达高于乳腺上皮细胞系MCF-10A（图9B）。FUSCC蛋白质组数据显示UQCRFS1蛋白在TNBC组织中上调（图9C）。Westernblot分析证实TNBC细胞系中UQCRFS1蛋白水平显著升高（图9D）。收集含1例TNBC患者的空间转录组数据集，显示UQCRFS1主要在肿瘤区域表达（图9E、F）。

此外，为探究UQCRFS1对TNBC细胞的功能影响，在MDA-MB-231和BT549细胞中敲低UQCRFS1（图9G），进行一系列体外和体内功能实验。CCK-8实验显示敲低UQCRFS1显著抑制TNBC细胞增殖（图9H）。Transwell和集落形成实验显示敲低UQCRFS1显著抑制迁移和集落形成（图9I-K）。体内实验中，稳定敲低UQCRFS1的MDA-MB-231和BT549细胞构建异种移植模型（图9L），发现敲低UQCRFS1可抑制异种移植肿瘤的重量和生长曲线（图9M-P）。总之，这些结果表明UQCRFS1在体外和体内促进TNBC细胞增殖和迁移，提示其可能是TNBC的潜在生物标志物。

图9

总结：研究揭示TNBC免疫微环境异质性，发现IL32high Treg与不良预后相关，构建的MCI模型可预测预后及免疫治疗耐药，UQCRFS1可促进TNBC进展，为治疗提供新靶点。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！