题目：肠涤清汤通过抑制炎症巨噬细胞活化和调节肠道菌群改善结肠炎

英文名：Changdiqing decoction (CDQD) ameliorates colitis via suppressing inflammatory macrophage activation and modulating gut microbiota

杂志：Phytomedicine

影响因子：8.3

发表时间：2025年5月14日

研究背景：溃疡性结肠炎（UC）是一种非特异性炎症性肠病，发病机制复杂，现有治疗复发率高、副作用明显。巨噬细胞泛凋亡（炎症性程序性细胞死亡）、PI3K/Akt信号通路在结肠炎发病中起关键作用，肠道菌群失调与UC密切相关。肠涤清汤（CDQD）是医院经验灌肠方，已临床治疗UC多年，但其作用机制不明。

研究思路：以DSS诱导的急性结肠炎小鼠为模型，通过UHPLC–HRMS鉴定CDQD的化学成分，结合体内外实验、多组学分析、粪便微生物移植（FMT）、网络药理学和分子对接等方法，探究CDQD对结肠炎的治疗作用及调控巨噬细胞泛凋亡、肠道菌群和PI3K/Akt信号通路的相关机制。

研究结果：

1、肠涤清汤减轻DSS诱导的小鼠结肠炎

为评估药物安全性，检测连续7天接受不同浓度CDQD灌肠的小鼠肝肾功能。从实验第1天至终点，每日灌肠给予不同剂量CDQD（图1a）。第7天，对照组无直肠出血，DSS组有明显直肠出血（图1b），DSS+5 - ASA组和各CDQD治疗组直肠出血发生率显著降低。结肠炎严重程度与结肠长度缩短相关，与对照组相比，DSS组结肠明显缩短（p<0.05）（图1c），CDQD治疗组结肠长度显著改善，呈剂量依赖性，效果优于5 - ASA组（p<0.05）（图1d）。第4天，DSS组小鼠体重减轻、疾病活动指数（DAI）评分升高，表明结肠炎诱导成功（p<0.05），CDQD治疗显著缓解症状，高剂量组效果尤佳（p<0.05）（图1e - f）。H&E染色显示，CDQD治疗改善了DSS诱导的黏膜上皮损伤、隐窝破坏和炎症细胞浸润（图1g - h）。总体而言，CDQD治疗有效缓解小鼠结肠炎症状。

图1

2、肠涤清汤修复肠道屏障功能

肠道屏障功能障碍是UC疾病进程关键机制。用PAS染色和免疫荧光（IF）检测黏液屏障和紧密连接相关指标（图2）。PAS染色显示，DSS组小鼠结肠杯状细胞数量显著减少，CDQD干预显著恢复其数量（p<0.05）（图2a、c）。Claudin - 1、Occludin和ZO - 1免疫荧光染色表明，结肠炎破坏结肠紧密连接和机械屏障（p<0.05）（图2b），而CDQD干预显著增强肠道黏膜屏障和紧密连接完整性（p<0.05）。Occludin和ZO - 1恢复呈剂量依赖性，高剂量CDQD治疗效果更好（p<0.05）（图2d）。总之，CDQD干预有效恢复了肠道屏障并调节了肠道炎症。

图2

3、肠涤清汤减少结肠组织中的泛凋亡

重点深入研究结肠组织中的泛凋亡。用TUNEL染色检测结肠组织细胞死亡情况，用免疫印迹法量化泛凋亡相关蛋白（图3）。TUNEL染色显示，结肠炎诱导大量细胞死亡，CDQD治疗组TUNEL阳性细胞数量显著减少（p<0.05，图3a - b），表明细胞存活改善。泛凋亡是涉及焦亡、凋亡和坏死性凋亡相互作用的复杂细胞死亡过程。为探究泛凋亡在结肠炎中的作用，用免疫印迹法分析结肠组织中相关蛋白（图3c）。分析显示，焦亡关键指标Caspase - 1、Caspase - 3和NLRP3在DSS组激活显著升高，表明焦亡发生，CDQD治疗显著逆转这种激活（p<0.05，图3d）。凋亡和坏死性凋亡相关生物标志物也有类似趋势（p<0.05）。重要的是，泛凋亡核心蛋白ZBP1在结肠炎时上调，CDQD治疗显著下调其表达。

图3

4、肠涤清汤减轻BMDMs的泛凋亡

巨噬细胞是炎症过程重要部分。选骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）为巨噬细胞模型，提取其RNA和蛋白质用于后续实验（图4）。与体内研究相似，免疫印迹法分析BMDMs中关键泛凋亡生物标志物，结果显示共刺激时焦亡、凋亡和坏死性凋亡均被激活，ZBP1显著上调，CDQD治疗显著降低ZBP1水平（p<0.05）（图4a - b）。建模后巨噬细胞相关炎症因子表达上调，CDQD干预后下调（p<0.05）（图4c）。

进一步用siRNA转染验证功能，免疫印迹分析显示si - ZBP1#1和si - NLRP3#2基因沉默效果显著，用作靶向ZBP1和NLRP3的特异性siRNA。PI染色、LDH和促炎细胞因子水平分析表明，沉默ZBP1或NLRP3对诱导的泛凋亡和炎症有治疗作用（p<0.05）。但基因沉默基础上，CDQD未显示更好治疗效果（p>0.05），证明ZBP1和NLRP3是CDQD关键治疗靶点。                                                  

图4

5、肠道菌群在肠涤清汤的抗结肠炎作用中起关键作用

为探究肠道菌群在CDQD抗结肠炎作用中的参与情况，收集对照组、DSS组和DSS+CDQD - H组粪便样本进行16SrRNA测序（图5）。门水平上，与对照组比，DSS组拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著降低，疣微菌门和变形菌门显著增加，CDQD干预部分恢复了这些变化（图5a）。生成热图可视化丰度差异聚类情况（图5b）。肠道菌群多样性对结肠炎有保护作用，本研究中，CDQD干预显著减轻DSS诱导的多样性降低（p<0.05）（图5c - d）。主坐标分析（PCoA）显示各组肠道菌群组成差异明显（图5e）。生成流图可视化与结肠炎相关的特定属水平细菌变化（图5f），并经统计检验和三元图进一步证实（图5g - h）。与DSS组相比，CDQD干预显著上调结肠炎中保护性细菌丰度，如Akkermansia muciniphila、Lactobacillus murinus和Parabacteroides goldsteinii。功能富集分析表明，肠道菌群结构变化主要富集在氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢及细胞生长和死亡相关通路（图5i）。

图5

采用代谢组学分析深入探究肠道菌群作用机制（图6）。各组间代谢物组成有显著差异（图6a - b），生成热图展示前20种差异代谢物，部分源自中药的化合物（如黄芩素和五味子素C）在不同组间差异显著（图6c）。KEGG通路分析显示富集通路有精氨酸和脯氨酸代谢、铁死亡和脂肪酸生物合成（图6d）。正交偏最小二乘判别分析（OPLS - DA）根据变量重要性投影（VIP）值确定组间显著差异代谢物（图6e）。此外，进行16S - 代谢物相关性分析，热图展示门、属和种水平上与关键细菌显著相关的化合物（图6f - h）。芦荟素与有抗结肠炎作用的乳杆菌属和另枝菌属增加显著相关，草药来源的化合物Cynarin和SchisandrolA与Lactobacillus murinus上调显著相关，表明CDQD药用成分可能通过调节微生物组成减轻结肠炎。总之，DSS诱导结肠炎期间，CDQD干预显著改变肠道菌群结构和代谢物组成。

图6

6、粪便微生物移植（FMT）表明CDQD调控的肠道菌群具有抗结肠炎作用

评估了CDQD调控的肠道菌群的潜在抗结肠炎作用。将DSS+高剂量CDQD处理小鼠（供体）的粪便微生物移植到DSS诱导的结肠炎小鼠（受体）中（图7a），同时设DSS+DSSfe组排除结肠炎模型小鼠粪便微生物的可能干扰。与DSS组相比，DSS+CDQDfe组在体重、DAI评分、结肠长度和组织学特征方面均显著改善（p<0.05）（图7b - h）。总之，CDQD调控的肠道菌群在减轻结肠炎和修复肠道屏障方面功效显著。

图7

7、PI3K/Akt信号通路的调控是肠涤清汤治疗作用的重要机制

进行16SrDNA测序分析鉴定潜在治疗靶点（图8）。两组间鉴定出13,514个交集基因（图8a），其中有1078个差异表达基因（DEGs），含82个上调基因和996个下调基因（图8b）。主成分分析（PCA）显示两组有显著遗传差异（图8c）。生成热图和火山图分别展示层次聚类与突出关键差异基因（图8d - e）。用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析DEGs功能。KEGG分析显示显著富集在调节细胞功能和凋亡的钙信号通路与PI3K/Akt信号通路，还鉴定出炎症相关通路如MAPK和cAMP信号通路（图8f）。GO分析显示相关术语显著聚类（图8g）。联合分析表明，与CDQD治疗相关的关键基因可能影响细胞周期调控等过程，基因集富集分析（GSEA）支持此发现。基于p值和富集分数（ES）值，PI3K/Akt信号通路是调节细胞周期和炎症的基本机制（图8h）。MAPK信号通路对炎症重要，细胞因子 - 细胞因子受体相互作用与细胞活性密切相关。基于这些结果，未来研究将确定PI3K/Akt是否参与CDQD治疗机制。

图8

8、网络药理学分析表明PI3K/Akt是重要的治疗靶点

采用UHPLC–HRMS技术检测CDQD的活性成分（图9）。在正离子和负离子基峰色谱图（BPCs）中，共标记了45个高丰度色谱峰（图9a-b）。在检测到的化合物中，标记的化合物包括黄酮类、异黄酮类、十八碳烯类、酪氨酸生物碱、脂肪酸及其缀合物、三萜类、小肽、多环芳香聚酮类等（图9c-d）。随后，进一步分析了这些化合物的结构及其潜在的草药来源（图9e-k）。

利用UHPLC–HRMS检测到的化合物进行网络药理学分析。从GeneCards、OMIM和DisGeNET等数据库中提取了3216个与UC相关的疾病基因。总之，结果表明PI3K/Akt信号通路与CDQD治疗结肠炎的机制相关，特别是靶向Akt1和PIK3R1。后续的研究将重点进一步阐明这一机制。

图9

9、肠涤清汤抑制结肠炎中PI3K/Akt信号通路的激活

采用同步双重免疫荧光染色定位结肠组织中磷酸化Akt（p - Akt）和巨噬细胞标志物F4/80的共定位情况（图10）。对照组中，p - Akt和F4/80共定位极少（图10a - b）；DSS刺激后，共定位显著增加，表明巨噬细胞中p - Akt激活（p < 0.05）；CDQD治疗显著减少共定位区域，与炎症减轻一致（p < 0.05）。这些发现表明PI3K/Akt和巨噬细胞可能是CDQD治疗效果的重要中介。

免疫印迹分析显示，结肠组织中DSS组Akt和PI3K磷酸化比率升高，CDQD干预后显著降低，p - Akt下调与CDQD剂量呈依赖性关系（p < 0.05）（图10c - d）。对BMDMs分析表明，IFN - γ和KPT - 330共刺激后PI3K/Akt信号通路显著激活，CDQD干预后被下调（p < 0.05）（图10e - f）。总之，CDQD有抑制结肠组织和BMDMs中PI3K/Akt信号通路激活的潜力。

图10

总结：肠涤清汤通过抑制巨噬细胞泛凋亡、下调PI3K/Akt信号通路活性、调节肠道菌群组成及代谢，显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎，为UC的中药灌肠治疗提供了理论依据。