题目：基于分子亚型的免疫相关标记预测肝细胞癌预后和免疫治疗效果

英文名：An immune-related signature based on molecular subtypes for predicting the prognosis and immunotherapy efficacy of hepatocellular carcinoma

杂志：Frontiers in Immunology

影响因子：5.9

发表时间：2025年5月19日

研究背景：免疫治疗是包括肝细胞癌（HCC）在内多种恶性肿瘤的关键疗法。但HCC早期症状不特异、异质性显著，多数患者确诊时已晚期，无法根治手术，即便采用免疫和靶向治疗，5年生存率仍低于20%。目前基于RNA测序的预后评估模型操作复杂、成本高，而免疫组织化学（IHC）实用经济，因此亟需构建基于HCC分子亚型和免疫相关基因的预后模型，并通过IHC验证以促进临床转化，为精准免疫治疗提供指导。

研究思路：本研究先利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路，通过基因集变异分析（GSVA）和共识聚类分析区分HCC分子亚型；在TCGA - LIHC队列中，结合免疫相关基因筛选出亚型特异性免疫相关差异表达基因（SIRDEGs）。随后，通过单变量、Lasso和多变量Cox回归分析构建亚型特异性免疫相关预后模型（SIR - PS），并在多个预后队列、一个免疫治疗队列、不同HCC细胞系和组织芯片中验证。同时，通过肿瘤微环境分析、突变分析、空间转录组分析、qPCR、Western blotting等实验探索模型临床意义及调控免疫治疗效果的潜在机制。最终，结合IHC染色评估模型在临床实践中的应用价值。

图1

研究结果：

1、基于KEGG通路的HCC亚型鉴定与富集分析

利用基于GSVA算法的KEGG基因集富集得分，对样本进行无监督层次聚类，将其分为两个不同亚型，并用聚类热图、共识CDF图、平均轮廓宽度和模糊聚类比例算法验证分类稳定性（图2A - C）。随后，比较分析不同亚型的临床因素，用热图可视化（图2D），并用堆叠柱状图突出显示亚型间有显著差异的因素（图2E）。与Sub2相比，Sub1特征是甲胎蛋白（AFP）水平升高、组织学分级更高、病理分期和T分期更晚、女性患者比例更高且中位年龄更低。Kaplan - Meier分析显示，Sub2患者预后优于Sub1患者（图2F）。对Sub1的富集分析显示，在四个数据库中，Sub1富集的基因均与免疫缺陷疾病相关（图2G）。此外，对亚型间免疫检查点表达水平的分析表明，Sub1中免疫检查点基因整体表达水平显著高于Sub2（图2H）。

图2

2、SIR-PS模型的构建与验证

从TCGA-LIHC队列和ImmPort数据库获取239个免疫相关差异表达基因（图3A）。经单变量Cox和Lasso回归分析，最终筛选出5个关键SIRDEGs用于构建预后模型（图3B、C）。在TCGA队列中，按中位风险评分将患者分为高、低风险组，结果显示随风险评分上升，患者死亡率及4个特征基因表达均逐步升高（图3D、E）。Kaplan-Meier分析进一步证实高风险组预后显著较差（图3F），其1年、3年AUC分别为0.771和0.727（图3I）。该模型在多个外部验证队列中表现一致：ICGC队列中高风险组总生存期更短（图3G），1年、3年AUC为0.791和0.751（图3J）；GSE54236与GSE202069队列同样显示高风险组预后较差（图3H），且两个队列的1年、3年AUC均保持较高水平（图3K），进一步证实SIR-PS具有稳健的预测能力。

图3

3、 SIR-PS的临床意义与肿瘤微环境探索

为探究SIR-PS与临床病理特征的关系，分析显示高风险组与多个HCC特征显著相关（图4A），具体表现为AFP水平升高、Sub1亚型和女性比例更高、组织学分级更晚、病理分期和T分期更进展。通过CIBERSORT算法分析免疫细胞浸润发现，高风险组记忆B细胞和调节性T细胞等浸润增加，而活化NK细胞等减少（图4B）。同时，高风险组多数免疫检查点基因表达上升（图4B）。在免疫治疗队列中，高风险组患者响应率更高（图4C），风险评分预测治疗响应的AUC达0.787（图4D）。

图4

4、SIR-PS的空间转录组分析

首先，分析了低风险组和高风险组中突变频率最-高的10个基因。肿瘤突变图谱显示，在TCGA数据库中，高风险组和低风险组中突变频率最-高的基因分别是TP53（突变频率40%）和CTNNB1（突变频率33%）（图5-A、B）。为确定模型发挥作用的细胞类型，分析了HCC患者的空间转录组数据，结果显示肝癌细胞中的风险评分最-高，表明患者的SIR-PS风险评分主要由这些癌细胞的风险评分决定（图5C），同时STC2和BIRC5主要在肝癌细胞中表达。

图5

5、HCC细胞系中的qPCR和Western blotting验证

基于空间转录组分析结果，选择SNU-449、97H、Hep3B和Huh7四种HCC细胞系进行细胞水平验证，其中SNU-449和97H细胞系的恶性程度或转移能力高于Hep3B和Huh7细胞系，通常意味着更差的预后。无论是qPCR还是Western blotting检测，STC2和BIRC5在SNU-449和97H细胞系中的表达水平均高于Huh7和Hep3B细胞系（图5D、E），与它们的恶性程度一致，而EPO和GLP1R在mRNA和蛋白质水平上未显示出明显的表达趋势。

6、基于HCC组织芯片IHC染色的SIR-PS验证

基于四个特征基因的预后潜力，对HCC组织芯片进行了IHC染色分析。结果显示，与正常组织相比，STC2、BIRC5、EPO和GLP1R在HCC组织中表达均显著升高（图6A–D）。进一步按IHC评分将患者分为高、低表达组，Kaplan-Meier分析表明，这四种基因高表达患者的预后均显著较差（图6E–H）。

图6

基于上述四基因的IHC评分，我们进一步利用SIR-PS模型计算每位患者的风险评分，并将患者划分为高、低风险组。Kaplan-Meier分析显示，在整个组织芯片队列中，高风险组患者预后显著更差（图7A）。时间-ROC曲线显示，该模型预测1年和3年生存率的AUC值分别为0.711和0.795（图7B）。

作为对比，我们还评估了临床常用标志物GPC3和CK19在同一队列中的预后价值。Kaplan-Meier分析表明，两者高、低表达组间的生存差异均不显著（图7C、E）。其1年和3年AUC值也普遍较低（图7D、F），提示SIR-PS模型在预后预测方面优于传统标志物。

图7

7、预后模型影响免疫治疗效果的机制探索

由于风险评分在接受抗PD1/PDL1治疗的肝癌免疫治疗队列中具有良好的预测效果，SIR-PS可能通过影响PDL1表达来调控免疫治疗efficacy。在TCGA-LIHC队列中，STC2和BIRC5的表达水平及风险评分与PDL1表达水平呈正相关（图8A、B、E、F），表明STC2和BIRC5均能促进癌细胞上PDL1的表达，从而促进肿瘤免疫逃逸，而EPO和GLP1R与PDL1之间无明显相关性（图8C、D）。进一步探索了STC2和BIRC5调控PDL1的潜在机制，由于基因表达可能通过miRNA相互影响，利用MultiMiR包筛选TarBase数据库中经实验验证的、可结合STC2、BIRC5和PDL1的miRNA，共筛选出87个靶向PDL1的miRNA，其中PDL1与STC2共有61个miRNA，PDL1与BIRC5共有48个miRNA（图8G、H、表4）。

图8

总结：本研究构建了HCC预后模型（SIR-PS），该模型结合IHC技术具有操作便捷、成本低的优势，预测性能优于GPC3、CK19等传统标志物，为HCC患者个体化预后评估和免疫治疗选择提供可靠工具，助力推动HCC精准免疫治疗临床应用。